Il 20 dicembre 1940 il Nani, al comando del capitano di corvetta Gioacchino Polizzi, partì da Bordeaux per riprendere la missione interrotta nelle acque a ponente dell’Irlanda. A causa del ritardo causato dal precedente contrattempo, il sommergibile ricevette l’ordine di seguire la rotta più breve per l’avvicinamento all’area operativa.

Il 1° gennaio 1941 il battello andò a formare una linea d’attacco ad ovest del Canale del Nord (da mantenere fino al 18 gennaio) insieme ai sommergibili italiani Glauco e Leonardo Da Vinci (i tre battelli italiani formavano un gruppo denominato proprio «Nani») ed ai tedeschi U 38 e U 124, ma non diede più notizia di sé dopo il 3 gennaio 1941, data del suo ultimo segnale ricevuto a Bordeaux.

Alle 15.06 del 7 gennaio Betasom chiamò tre dei suoi sommergibili in missione, e solo il Nani («64 W») non rispose; così come rimase silente alle nuove chiamate, tre giorni dopo, alle 15.09 del 10 gennaio. Qualche ora dopo fu ripetuto lo stesso segnale, ma di nuovo senza risposta, al pari dei successivi.

Il Nani fu dichiarato perduto per circostanze ignote – forse anche il maltempo – ed in data imprecisata tra il 3 gennaio, data del suo ultimo contatto radio con la base, ed il 20 febbraio 1941, ultima data possibile per il suo ritorno alla base. Scomparvero con l’unità il comandante Polizzi, altri 6 ufficiali e 48 tra sottufficiali, sottocapi e marinai.

Nel dopoguerra, da fonte ufficiale britannica, risulta che l’unità venne affondata il 7 gennaio 1941 dalla corvetta HMS Anemone Comandata dal Lt. Cdr. Humphry Gilbert Boys Smith, a sud est dell’Islanda in posizione 60°15’ Nord – 015°27’ Ovest (Atlantico), posizione molto più a nord della posizione che gli era stata assegnata, si presume che il battello era all’inseguimento di qualche convoglio.